PCR法测细胞培养的支原体污染

PCR法测细胞培养的支原体污染

原理

利用特殊专一性的引物，经PCR反应来复制支原体DNA。所用的引物来自支原体的保守16S-23S的rRNA序列，由于这段spacer的序列随支原体种类不同而不同，因此可依所复制的DNA大小及其特异性片段的大小来作检测及鉴定。

特点

灵敏及快速，可检测到不易培养的支原体，不必培养支原体作阴阳性对照，避免可能带来的污染。

缺点

PCR反应很灵敏，容易带来假阳性结果，仅能作为参考。

材料与设备：

ATCC支原体检测试剂盒（可作50-100个反应，提供第一阶段引物混合物与第二阶段引物混合物，有DNA阳性对照(A. laidlawii, M. pirum)），PCR反应试剂（Taq聚合酶，dNTP，10xPCR buffer，25mM 氯化镁，PCR水），PCR仪，琼脂糖胶电泳设备，手套，无菌PCR反应管，无菌1.5ml微量离心管，无菌2ul、20ul、200ul、1000ul枪头。

引物序列

  • 第一阶段引物混合物：1. ACACCATGGGAG（C/T）TGGTAAT，2. CTTC（A/T）TCGACTT（C/T）CAGACCCAAGGCAT，3. AAAGTGGGCAATACCCACGC，4. TCACGCTTAGATGCTTTCAGCG
  • 第二阶段引物混合物：1. GTG（C/G）GG（A/C）TGGATCACCTCCT，2. GCATCCACCA（A/T）A（A/T）AC（C/T）CTT，3. CCACTGTGTGCCCTTTGTTCCT

操作过程

  1. 第一阶段的PCR反应：加样品2ul（直接取待测细胞培养液、支原体DNA(+)、PCR水(-)），10x buffer（含1.5mM氯化镁）2.5ul，第一阶段引物混合物0.5ul，dNTP（1.25mM each）1.0ul，氯化镁（25mM）0.5ul，Taq DNA 聚合酶（5U/ul）0.1ul，PCR水18.4ul至PCR管，混匀，放入PCR仪反应。
  2. PCR 反应（第一阶段与第二阶段同）：94℃变性（30秒），94℃（30秒）、55℃（2分钟）、72℃（2分）30循环，72℃延伸（5分钟），4℃保存
  3. 第二阶段PCR反应：加样品1ul（第一阶段产物），10x buffer（含1.5mM氯化镁）2.5ul，第一阶段引物混合物0.5ul，dNTP（1.25mM each）1.0ul，氯化镁（25mM）0.5ul，Taq DNA 聚合酶（5U/ul）0.1ul，PCR水19.4ul至PCR管，混匀，放入PCR仪反应，反应程序同2。
  4. 琼脂糖凝胶电泳：2.0%琼脂糖凝胶（含EB），1xTAE电泳缓冲液，选择100-500bp DNA marker，第二阶段反应产物各取10ul加入2ul loading dye（6x），电泳分离（100V，25分钟），紫外灯下观察并照相记录。

结果判断

不同种支原体第二阶段PCR得到的片段大小为：

M. arginini 236bp， M. fermentas 365bp， M. hominis 236bp， M. hyorhinis 315bp， M.oral 290bp，M. pirum 323bp， M. salivarium 269bp， M. laidlawii 426bp+219bp（电泳结果参见左上图）。

* 本文内容主要来自台湾国家卫生研究院细胞库